在生物医学研究的细胞培养日常中，我们常常会遇到一些状况不佳的细胞：细胞变圆、漂浮、不附壁、颜色变暗、增殖缓慢等现象。很多时候，我们可能会误以为这些细胞无法继续存活，迅速选择放弃并更换新细胞。但其实，有些细胞的“垂死挣扎”只是暂时的状态，是可以被逆转的。本文将详细介绍在何种情况下细胞尽管状态不佳但依然有恢复希望，以帮助科研人员减少不必要的浪费，节约宝贵的细胞资源。

一、变圆、漂浮≠死亡：细胞贴壁差异需辨析

许多贴壁细胞，如HeLa、293T、MCF-7，在健康状态下应紧密附着于培养瓶底。然而，当它们出现变圆或漂浮的现象时，通常会被误判为死亡。

可能的原因包括：

• 换液或传代操作过于剧烈，导致机械扰动或胰酶消化时间过长，影响细胞附着；
• 刚复苏不久的细胞状态较差，可能需要更长时间才能正确贴壁（一般需12-24小时）；
• 培养基不适或血清浓度过低，影响细胞粘附分子的表达。

抢救措施：

• 静置培养瓶观察24小时，避免频繁晃动；
• 增加血清浓度（如将其由10%提升至15%）；
• 采用多聚赖氨酸或明胶包被以增强细胞贴壁能力。

二、颜色发暗、胞浆颗粒增多：可能是“应激状态”而非死亡

在显微镜下，细胞颜色发暗、胞浆颗粒增多，有时会被误认为是坏死的迹象，实际可能是细胞处于应激状态。

例如：

• 培养基pH变化（颜色发黄或变紫）；
• 缺氧、营养不足；
• 感染轻度支原体/细菌；
• 代谢产物积累，未及时更换培养液。

抢救措施：

• 更换新鲜培养基，并必要时添加Hepes缓冲剂以维持pH；
• 检查是否有污染；
• 补加胰岛素、转铁蛋白、谷胱甘肽等抗应激因子以支持细胞恢复。

三、增殖迟缓甚至停滞：可能是休眠不是死亡

细胞状态不佳常表现为几天无增殖，尤其见于初代培养细胞、冻存复苏的原代细胞、iPSC类细胞及神经干细胞等敏感类型。

此类细胞常因胞内调控机制失衡而进入休眠状态，如G0期停滞。

抢救措施：

• 补加细胞因子或小分子化合物（如bFGF、EGF、Y-27632）以刺激细胞激活；
• 尝试低密度共培养与健康细胞，提高细胞间信号传导；
• 使用培养基优化试剂包（如StemFlex、Neurobasal-B27）对症下药。

四、看似死光的冻存细胞，或许只是复苏方法不当

冻存细胞复苏后如果贴壁率低，漂浮现象明显，甚至看似没有存活细胞，可能是操作手法的问题。

可能的原因：

• 复苏后直接离心，再更换培养基，造成细胞机械损伤；
• 去除DMSO不及时或操作缓慢，导致细胞暴露于毒性环境时间过长；
• 培养基温度不适合，细胞可能进入休眠或凋亡状态。

抢救措施：

• 在37℃水浴中快速复苏（<1分钟），并直接加入预热的培养基以稀释DMSO，避免立即离心；
• 添加ROCK抑制剂Y-27632（10μM）以显著提升复苏后的贴壁率与存活率，尤其对ES/iPS细胞效果显著。

五、染色看似“全死”的细胞也可能有生机

在使用台盼蓝（Trypan Blue）或PI染色判断细胞活性时，若染色阳性较多，通常被视为死亡，然而这也可能因细胞膜暂时性破裂或染色时间过长导致假阳性。

抢救措施：

• 使用流式细胞术结合Annexin V/PI染色，区分凋亡与坏死；
• 让细胞继续培养并观察其贴壁与增殖情况，切勿盲目丢弃；
• 考虑再培养12-24小时，部分细胞可能仍可恢复功能。

六、污染≠报废：部分污染是可控的

虽然严重污染，如真菌或细菌大量繁殖，确实应立即报废，但有些轻度污染或早期污染是可以通过处理保住的细胞。

抢救措施：

• 对培养瓶表面的霉点，可转瓶并添加抗生素进行密切观察；
• 偶发的颗粒状漂浮物可能是血清蛋白析出或培养基变质，并非污染。

许多细胞状态不佳的情况，实际上并非不可挽救。在生物医学研究中，我们不仅要依赖经验判断，还需进行科学观察和合理干预策略。正如对待科研中的问题一样，细胞看似不行并不意味着失败。只要方法得当、处理及时，许多情况下细胞都能“起死回生”。金年会金字招牌诚信至上，为您的生物医学研究提供更可靠的支持。